NC：菌群标志物鉴定×因果关系验证 | 微生物专题
论文标题：Functional and metabolic alterations of gut microbiota in children with new-onset type 1 diabetes
刊登日期：2022年09月
发表杂志：Nature Communications
影响因子：17.694
技术手段：16S rRNA基因测序、宏基因组测序、代谢组、转录组
（一）研究背景
1型糖尿病(T1D)的特征是由与遗传易感性相关的自身免疫攻击引起的β细胞破坏和胰岛素缺乏。然而T1D的发病率在全球范围内逐年上升，突出了环境因素的重要性。研究揭示，肠道菌群在许多代谢功能中发挥作用，然而目前还缺乏对T1D肠道菌群功能和代谢组的全面分析。
（二）研究设计
发现队列（64名T1D患儿 VS 77名正常儿童）；
验证队列（29名T1D患儿 VS 29名正常儿童）；
采集发现队列和验证队列儿童的粪便和血液样本；
1、T1D患儿肠道菌群的结构变化及功能分析
①对发现队列粪便样本进行16S rRNA基因测序（以下简称16S测序）和宏基因组测序；
2、T1D患儿代谢模式
①对发现队列采集的粪便样本进行非靶代谢组检测；
3、粪菌移植影响抗菌素处理的无菌小鼠血糖水平和肠道菌群
①构建抗菌素处理的无菌小鼠模型（饲喂氨苄西林、甲硝唑、硫酸新霉素和万古霉素）；
②随机收集3例T1D患儿和3例健康儿童的粪便制备成粪便混合液灌胃给小鼠，尾静脉血检测血糖变化；；
③收集上述处理小鼠的粪便样本（9-10只/组）进行16S测序；
4、丁酸盐和LPS在糖尿病模型小鼠中的作用
①T1D模型小鼠构建（小鼠腹腔注射低剂量STZ(链脲佐菌素)诱导T1D小鼠）；
②丁酸盐处理组：在糖尿病模型小鼠灌胃丁酸钠（10-12只）；
③LPS（脂多糖）处理组：在糖尿病模型小鼠腹腔注射LPS（10-12只）；
④正常对照组和模型组分别灌胃等量的生理盐水或PBS；
⑤分别收集四组中胰腺组织进行转录组测序；
首先，作者在两个独立的发现集和验证集队列中，通过16S测序、宏基因组和非靶代谢组联合分析探究初发T1D患儿肠道微生物功能和代谢水平的变化，探明T1D患儿肠道菌群结构和多样变化；接着作者构建抗生素处理的无菌小鼠模型，通过粪菌移植检测T1D患儿肠道菌群对无菌小鼠血糖水平和肠道菌群差异的影响（16S测序）。此外，在链脲霉素诱导的T1D小鼠模型中，通过转录组测序在分子水平上探究丁酸盐和LPS分别对小鼠胰岛结构和功能的影响。该研究揭示了初发T1D儿童肠道微生物功能和代谢的紊乱，为基于微生物群的T1D预防和干预提供了潜在的途径。
图1 研究设计与流程图
（三）研究发现
1. T1D患儿肠道菌群的结构变化及功能分析
图2 T1D患儿肠道微生物群的结构变化
作者首先对发现集64名T1D患儿和77名正常儿童的粪便样本进行16S测序，结果表明T1D组微生物区系丰富度和多样性显著低于NC组；两组间的微生物群落结构存在显著性差异，T1D组内的组成差异显著增加（图2a-d）。在门水平上，T1D组厚壁菌门（Firmicutes）的丰度显著低于NC组，拟杆菌门（Bacteroidetes）和变形菌门(Proteobacteria)的丰度显著高于NC组（图2e）；在属水平上T1D组中生物紊乱特征是Firmicutes中普式粪杆菌（Faecalibacterium），布劳氏菌（Blautia）及毛螺菌（Lachnospira）等产生丁酸盐的属减少，拟杆菌（Bacteroides)、副杆菌（Parabacteroides）等增加。此外，验证组检测的菌群分布于发现集没有显著差异；在对地理区域和疾病状态亚组进行分析时，发现集和验证集也未发现总体细菌结构有显著差异。为构建T1D最优分类模型，作者通过随机森林分析及交叉验证从126高丰度属中选定22个属作为具有最佳识别力的关键属。这些关键属在T1D上表现出中等的区分效果，发现集和验证集的曲线下面积(AUC)值分别为0.815和0.649(图2i)。
图3 宏基因组测序显示的与T1d相关的微生物种类
作者利用宏基因组测序进一步分析了种水平上的微生物群及其功能，结果表明，产丁酸盐的菌种，如普氏粪杆菌（Faecalibacterium）、直肠真杆菌（Eubacterium rectale）、Roseburia intestinalis等与NC组相比在T1D组小鼠场内降低。由随机森林模型，选取35种菌种作为T1D最具鉴别力的菌种，将这些菌种分为两类，Cluster 1主要由产丁酸的菌组成，而Cluster主要由机会致病菌组成。Spearman对临床指标与鉴定种的相关性分析显示，血红蛋白A1c（HbA1c）、空腹血糖（FBG）和甘油三酯（TG）与Cluster 1呈负相关，与Cluster 2呈正相关；在高密度脂蛋白胆固醇（HDC-C）中则相反（图3b）。肠道菌群可能参与了T1D组中的糖代谢、脂代谢和炎症反应的调节。
图4 T1D患儿的微生物功能改变
作者通过对粪便样本的宏基因组测序数据进一步分析，与NC组相比T1D组的基因数、Chao 1和Shannon指数显著下降（图4a-c）。PCoA分析表明与NC组相比，T1D组的组成差异更大（图4d-e）。KEGG富集分析表明相比于NC组，T1D组淀粉和蔗糖代谢水平较低，脂多糖(LPS)合成水平较高。此外，T1D组编码碳水化合物活性酶(CAZy)基因的总丰度显著低于NC组，主要与淀粉、糖原、蔗糖和果糖代谢相关（图4h）；T1D组中大多数丁酸盐产生途径相关的基因被下调(图4j）；丁酸盐代谢相关基因在NC组和T1D组中分别占基因总丰度的16.27%和10.35%，T1D组与LPS合成相关的基因总丰度显著增加(图3m)(图4l-m）；综上所述，宏基因组分析显示，与对照组相比T1D组中的微生物功能图谱受到干扰，涉及到LPS生物合成增加，丁酸盐生成、碳水化合物代谢和胆汁酸代谢减少等功能。
2. T1D患儿代谢活动异常
图5 T1D患儿的异常粪便代谢模式
为进一步研究T1D患儿中肠道菌群的生物学效应，作者使用粪便样本进行了代谢组学分析。与NC组相比，T1D组5种代谢物（L-焦谷氨酸、氨基喋呤、5-羟色氨酸、N1-乙酰精胺和3-(3-羟基苯基)-3-羟丙酸）水平显著升高；甘草脱氧胆酸、糖苷脱氧胆酸等21种代谢物水平显著降低（图5a）。通过KEGG途径富集分析，有3种途径显著富集:果糖和甘露糖代谢途径、半乳糖代谢途径和咖啡因代谢途径。另外T1D组粪便中锻炼脂肪酸（SCFAs）、丁酸、乙酸和胰高血糖素样肽1 (GLP-1)的总浓度明显低于NC组(图5b-d)。与NC组相比，T1D组的成纤维细胞生长因子19 (FGF19)、LPS结合蛋白(LBP:来自肠道细菌的抗原负载的替代标记物)和促炎细胞因子白细胞介素-1β (IL-1β：LPS22刺激产生的促炎细胞因子)水平均显著升高(图4e)，
接着作者利用关键细菌种类和粪便代谢物的组合构建了随机森林回归模型，以筛选T1D相关的生物标志物。对35种关键细菌和28种粪便代谢物的组合分析显示，9种细菌和9种粪便代谢物的组合具有最佳的鉴别力(图5i)。与单独使用微生物组生物标志物相比，细菌种类和粪便代谢产物的联合标记在发现集(AUC值从0.815增加到0.976)和验证集(AUC值从0.649增加到0.809)中对T1D患儿的识别都有了很大的提高(图4j)。
3. 移植T1D患儿相关肠道菌群引起的葡萄糖稳态紊乱
图6 T1D相关肠道微生物群移植诱导的葡萄糖稳态紊乱
为评估肠道菌群与T1D血糖变化之间的因果关系，作者将肠道菌群从T1D患儿和健康儿童移植到抗生素治疗的无菌小鼠中（图6a）。在没有外部刺激的情况下，T1D相关小鼠受体（FMTT1D）显示出比对照组（FMTNC）更高的空腹血糖（FGB）水平（图6b）。另外，胰岛素耐受试验显示与FMTNC组相比，FMTT1D组在胰岛素刺激30min后，血糖水平显著升高，表明胰岛素敏感性降低；然而，在补充丁酸盐后显著提高了胰岛素抵抗作用（图6c）。
为确定是否通过FMT（粪菌移植）影响肠道菌群差异，作者通过16S rRNA基因测序检测FMTT1D组与FMTNC组间的菌群结构，结果表明两组间显示出显著差异（图6d），与对照组相比，FMTT1D小鼠表现出Firmicutes/Bacteroidota比率降低和产生丁酸的Faecalibaculum的相对丰度降低（图6e-f）。此外，通过检测toll样受体4（TLR4）、MyD88和磷酸化核因子p-NF-κB/NF-κB蛋白在小鼠肝脏中表达情况以评估全身炎症反应。与FMTNC组相比，FMTT1D组TLR4、MyD88相对表达和p-NF-κB/NF-κB的比值显著增加，在血清水平中FMTT1D组的促炎细胞因子IL-1β（图6g–k）；综上，T1D相关的肠道微生物群可能诱发炎症和糖尿病的早期症状。
4.丁酸盐和LPS在STZ诱导的T1D小鼠中的作用
图7共生微生物诱导γδ T细胞增殖和IL-17A产生
作者为探索丁酸盐和LPS在STZ诱导的T1D小鼠中的作用。与未治疗的T1D小鼠相比，口服丁酸酯在T1D小鼠模型中发挥了抗糖尿病作用，其FBG、葡萄糖水平和HbA1c值显著降低；丁酸盐治疗组的血清C肽水平（T1D的关键诊断标准之一）显著升高（图7a-e）。然而，与未治疗的T1D小鼠相比LPS处理组显示FBG和葡萄糖水平增加，血清C肽水平降低（图7f-j）。免疫组织化学分析表明，与T1D小鼠相比，丁酸盐治疗减轻了STZ诱导的胰岛损伤，胰岛数量和总胰岛素阳性胰岛数量增加。与模型组相比，LPS处理组的胰岛数量更少，胰岛结构受损更多（图7k-m）。此外，在丁酸盐治疗组中，促炎细胞因子IL-1β降低，而LPS显著增加了IL-1β的分泌（图6n-o），这可能对胰岛结构和功能造成炎症损伤。综上，丁酸盐可减轻胰岛损伤并保护功能性β细胞，而LPS可进一步加重STZ诱导的糖尿病小鼠的胰岛损伤和功能障碍。
基于以上生理表型，作者通过转录组测序探究丁酸盐和LPS对胰腺组织的影响。在丁酸盐组、T1D模型组、LPS组和对照组构建了胰腺基因表达谱，在四个组中共鉴定625个差异表达基因，差异基因可聚类成三组：
①ClusterⅠ由与代谢途径相关的基因组成，这些基因在对照组和丁酸组中显著富集；
②ClusterⅡ主要由与免疫和刺激反应相关的途径组成，LPS组的免疫和刺激应答特异性上调；
③Cluster Ⅲ主要由与生物过程相关的通路和信号通路组成，这些通路在模型和LPS处理组中富集（图7p-q）。
在ClusterⅠ中，作者主要关注胰岛素前编码基因Ins1和Ins2，在丁酸盐治疗组的Ins1和Ins 2表达水平显著高于模型组，但LPS治疗组的表达水平低于模型组（图7r），这与免疫组化分析的结果一致。KEGG通路富集分析表明，与炎症和免疫反应相关的通路，包括糖尿病并发症中的AGE-RAGE信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶-Akt信号通路，与T1D组相比LPS治疗组主要上调，但丁酸酯治疗组下调。与T1D组相比，丁酸盐治疗组中与胰岛素信号传导相关的途径显著下调（图6u-v）。综上，丁酸盐和LPS治疗分别对T1D小鼠模型中的胰岛结构和功能产生保护和破坏作用。
总结：
作者通过多组学和动物实验揭示了肠道失调的功能和代谢特征，并探讨了肠道微生物群与T1D葡萄糖代谢失调之间的因果关系和潜在机制。主要结论如下：
（1）T1D相关的肠道失调以LPS生物合成增加、丁酸生成和胆汁酸代谢减少为特征；
（2）9种细菌和9种粪便代谢物的组合提升了对新发T1D的优异鉴别能力；
（3）人类T1D相关肠道微生物群可诱导抗生素治疗小鼠空腹血糖水平升高和胰岛素敏感性下降；
（4）丁酸盐和LPS分别对T1D小鼠的糖代谢和胰岛结构和功能产生保护和破坏作用。
小评：
该研究系统性地将16S测序、宏基因组测序、代谢组和转录组测序联合分析了肠道微生物功能和代谢变化及潜在机制，通过发现队列和验证队列坐实基于微生物组和代谢组鉴定到的T1D生物标志物。接着通过粪菌移植到无菌小鼠中正向验证肠道菌群功能和代谢水平上的作用；在T1D模型小鼠上利用相应代谢和功能产物反向验证微生物特征的重要效应。该研究的整体研究思路堪称保姆级，为探究肠道菌群整合了多方面的细节思路，值得借鉴。
相关阅读
肿瘤微生物＋多组学轻松登上33分的JAMA Oncology
所见即所得，绘图高规格联川云平台，让科研更自由